穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜，揭開單線態(tài)氧發(fā)光的面紗
導(dǎo)言
對于單線態(tài)氧，可能很多人都感到很陌生。但是對于我們賴以生存的氧氣，卻再也熟悉不過。單線態(tài)氧是激發(fā)態(tài)的氧氣分子，參與生物體內(nèi)很多重要的生物化學(xué)反應(yīng)，它猶如一把雙刃劍，既可以導(dǎo)致疾病的發(fā)生，又可以被人類應(yīng)用在醫(yī)學(xué)治療、環(huán)境治理等領(lǐng)域?？茖W(xué)家們正在積極研究單線態(tài)氧在各種生物化學(xué)反應(yīng)中的動(dòng)力學(xué)過程及機(jī)理， 試圖發(fā)掘出更多單線態(tài)氧可用于造福人類的潛能。
單線態(tài)氧是什么？
通常我們呼吸的氧氣分子性質(zhì)穩(wěn)定，屬于三線態(tài)氧分子3O2，如果我們從微觀角度去看，氧氣分子中兩個(gè)自旋平行的電子分別占據(jù)兩個(gè)2pπ*軌道，自旋多重性為3，稱為三線態(tài)。當(dāng)基態(tài)氧原子被激發(fā)后，原本兩個(gè)2pπ*軌道中兩個(gè)自旋平行的電子，既可以自旋相反地同時(shí)占據(jù)一個(gè)2pπ*軌道，也可以分別占據(jù)兩個(gè)2pπ*軌道。這兩種分子激發(fā)態(tài)下的自旋多重性均為1，也就是接下來要介紹的單線態(tài)氧分子1O2。
圖1. 不同氧氣分子的分子軌道能級圖
從分子軌道上的電子分布可以看到，單線態(tài)氧由于解除了自旋限制，化學(xué)性質(zhì)更活潑。它是一種含氧的非自由基活性物種，具有強(qiáng)氧化性，可以高選擇性奪取電子。多年的研究表明，單線態(tài)氧在酶反應(yīng)、細(xì)胞分裂、機(jī)體衰老、腫瘤等過程中都有參與作用。在一般情況下，細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧的濃度很低，而且單線態(tài)氧的產(chǎn)生和清除處于一個(gè)平衡的狀態(tài)，不會(huì)引起機(jī)體損傷。但是如果由于某種誘因，導(dǎo)致這種平衡被破壞，就可能引起膜脂過氧化，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，高活性的單線態(tài)氧也是一些化學(xué)和生物反應(yīng)過程中重要的中間體，如光氧化反應(yīng)[1]，光敏細(xì)胞毒性[2]，光動(dòng)力學(xué)治療[3,4]等。單線態(tài)氧產(chǎn)生機(jī)制對光動(dòng)力療法、抗癌藥物和其他皮膚治療的研究也都很重要。
單線態(tài)氧的產(chǎn)生可借助于光敏劑實(shí)現(xiàn)。光敏劑分子在氧氣中被光輻照后，其激發(fā)三重態(tài)與基態(tài)氧發(fā)生反應(yīng)，從而產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的單線態(tài)氧。這些光敏劑包括玫瑰紅、過渡金屬絡(luò)合物、卟啉、熒光素等。
圖2. 光敏劑作用下單線態(tài)氧產(chǎn)生過程示意圖
單線態(tài)氧的測量
目前探測單線態(tài)氧的方法主要有順磁共振、熒光光譜法、化學(xué)捕獲吸光度法、化學(xué)發(fā)光法、熒光探針法等。其中熒光光譜法已經(jīng)成為檢測單線態(tài)氧的常用手段。單線態(tài)氧的輻射復(fù)合發(fā)光位于1270nm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了人眼的可見波長范圍，且其發(fā)光較弱，需要使用靈敏度較高的近紅外探測器才可以檢測到。近年來隨著近紅外探測器性能逐漸提高，可選激發(fā)光源也越來越多，為單線態(tài)氧的檢測提供了很大的幫助。
本文采用卓立漢光公司的穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀OmniFluo990 對光敏劑孟加拉玫瑰紅在光照下與氧氣反應(yīng)所產(chǎn)生的單線態(tài)氧進(jìn)行測量，激發(fā)光源為532nm激光器，具有連續(xù)輸出和脈沖輸出兩種模式。單線態(tài)氧的發(fā)射光譜分別采用卓立漢光的近紅外InGAs探測器（型號：DInGaAs1700-03M）和濱松的近紅外PMT（型號：R5509-73）測試得到。
實(shí)驗(yàn)樣品準(zhǔn)備：把孟加拉玫瑰紅（Rose Bengal ，C20H2Cl4I4Na2O5）溶于分析純無水乙腈，測試之前，在溶液中通入氧氣飽和10分鐘。單線態(tài)氧
穩(wěn)態(tài)發(fā)光測試
穩(wěn)態(tài)光譜測試使用532nm激光器，能量為80mW。發(fā)射側(cè)光柵刻線密度為600g/mm，閃耀波長為750nm。掃描范圍設(shè)置為1220-1340nm，步長1nm，帶寬3nm，積分時(shí)間200ms，重復(fù)5次。發(fā)射側(cè)使用800nm高通濾光片消除倍頻峰信號干擾。近紅外R5509-73 PMT在1274 nm處測到單線態(tài)氧的發(fā)光峰，如圖3所示。
圖3. 單線態(tài)氧穩(wěn)態(tài)光譜圖（采用R5509 PMT）
圖4為使用卓立漢光近紅外InGaAs檢測器測試得到的結(jié)果。InGaAs為模擬信號檢測器，靈敏度要比PMT低，圖中可見單線態(tài)氧的發(fā)光峰信號強(qiáng)度相比NIR PMT要弱，譜線噪聲也略大。盡管如此，我們依然可以看到很明顯的單線態(tài)氧發(fā)光信號，包括峰位也和近紅外PMT結(jié)果一致。
圖4單線態(tài)氧穩(wěn)態(tài)光譜圖（采用InGaAs檢測器）
瞬態(tài)發(fā)光測試
發(fā)光壽命測試對從機(jī)理上研究單線態(tài)氧所參與的眾多光生物和光化學(xué)過程來說，具有重要的參考價(jià)值。單線態(tài)氧的壽命會(huì)受到光敏劑以及溶劑的影響，研究表明溶劑對其壽命的影響更大。單線態(tài)氧在溶液中很容易被多種溶劑淬滅，具有很強(qiáng)的溶劑依賴性。其中水就是一種*容易使單線態(tài)氧淬滅的溶劑，因?yàn)樗蠴-H鍵容易與單線態(tài)氧發(fā)生耦合反應(yīng)。因此，本次實(shí)驗(yàn)中所采用的乙腈為分析純的無水乙腈，避免單線態(tài)氧的信號被水淬滅。
本次實(shí)驗(yàn)所采用的瞬態(tài)光譜激發(fā)光源為532nm激光器，經(jīng)過調(diào)制得到脈沖激光，檢測器使用近紅外R5509-73 PMT。圖5數(shù)據(jù)經(jīng)過擬合，得到單線態(tài)氧壽命為60.7μs。
圖5. 單線態(tài)氧發(fā)光壽命測試（采用R5509 PMT）
單線態(tài)氧測試推薦儀器：
OmniFluo900穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀
配置推薦：
激發(fā)光源：532nm激光器，連續(xù)輸出和脈沖輸出兩種模式可調(diào)
檢測器：近紅外檢測器，可選卓立漢光自制InGaAs（型號：DInGaAs1700-03M）或者濱松的近紅外PMT（型號：R5509-73）
發(fā)射單色器：標(biāo)配三光柵塔輪，可安裝多至三塊光柵，其中近紅外光柵可用于單線態(tài)氧近紅外發(fā)光的分光。自動(dòng)濾光片輪，用于安裝800nm高通濾光片，消除倍頻峰信號對單線態(tài)氧發(fā)光峰的干擾
參考文獻(xiàn)
(1) Braun, A. M.; Maurette, M. T.; Oliveros, E. Photochemical Technology; Wiley: Chichester, U.K. 1991; pp 445-499.
(2) Cadenas, E. Annu. ReV. Biochem. 1989, 58, 79-110.
(3) Dougherty, T. J.; Gomer, C. J.; Henderson, B. W.; Jori, G.; Kessel, D.; Korbelik, M.; Moan, J.; Peng, Q. J. Nat. Cancer Inst. 1998, 90, 889-905.
(4) Ali, H.; van Lier, J. E. Chem. ReV. 1999, 9, 2379-2450.
13810146393
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